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实验准备: 在开始分析之前,需要准备样本和相关实验材料。样本可以是DNA的提取物,通常从血液、组织或细胞中提取。实验准备包括质量控制检查、DNA文库构建和测序芯片准备等。
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DNA文库构建: 将样本的DNA片段转化为适合测序的文库。这通常包括以下步骤: a. DNA片段切割:将长的DNA片段切割成较短的片段,通常为几百到几千碱基对。 b. 末端修复:修复DNA片段的末端,使其适合连接测序适配体。 c. 适配体连接:将测序适配体连接到DNA片段的末端,适配体包含与测序仪器兼容的序列。 d. PCR扩增:通过聚合酶链式反应(PCR)扩增适配体连接的DNA片段,以便在测序中产生足够的信号。
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测序: 将DNA文库放入测序仪器进行测序。有几种不同的测序技术可供选择,例如Illumina、Ion Torrent、PacBio和Oxford Nanopore等。这些技术使用不同的原理和方法来读取DNA序列。
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数据预处理: 从测序仪器中生成的原始测序数据称为"reads"。在进行进一步的分析之前,需要对这些数据进行预处理和质量控制,以去除低质量的reads和适配体序列。
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Trimmomatic:用于去除测序reads中的适配体序列、低质量碱基和低质量reads。你可以在 Trimmomatic GitHub 上找到更多信息和使用说明。
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FastQC:用于评估测序reads的质量分布和其他质量指标。它可以帮助检测测序过程中的潜在问题,如测序质量下降、适配体污染等。有关更多信息,请访问 FastQC网站。
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BWA-MEM:用于将测序reads比对到参考基因组上。BWA-MEM采用快速的seed-and-extend算法,能够高效地处理较长的reads。你可以在 BWA-MEM GitHub 上获取详细的文档和使用说明。
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Bowtie2:用于将reads比对到参考基因组。它结合了快速的seed-and-extend算法和最大可信权值路径算法,适用于短序列的比对。你可以在 Bowtie2官方网站 上了解更多信息。
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SAMtools:用于处理比对结果的工具集,可以进行SAM/BAM格式文件的转换、排序、索引和过滤。此外,它还提供了一系列命令行工具,用于统计比对信息、检测SNPs和Indels等。你可以在 SAMtools官方网站 上找到更多的文档和下载链接。
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GATK(Genome Analysis Toolkit):是一个用于基因组数据的分析和变异检测的工具集。它提供了多种算法和工具,包括基因组重比对、SNP/Indel检测、变异过滤等。有关详细信息,请访问 GATK官方网站。
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Picard Tools:用于处理SAM/BAM文件的工具集,可以标记PCR重复、计算覆盖度、创建统计报告等。你可以在 Picard Tools官方网站 上了解更多信息和使用说明。
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QualiMap:用于评估测序数据质量的工具,可以检测测序reads的覆盖度、GC含量、错误率等质量指标,并生成相应的统计图表和报告。有关更多信息,请访问 QualiMap官方网站。
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数据比对和基因组装: 将预处理后的reads与参考基因组进行比对或基因组装。比对是将reads与已知基因组序列进行比较,确定每个read在基因组中的位置。基因组装是将reads组合成更长的连续序列,以重建基因组的整体结构。
- 比对工具:
- BWA-MEM:用于将测序reads比对到参考基因组上。它采用快速的seed-and-extend算法,适用于处理较长的reads。你可以在BWA-MEM GitHub上获取详细的文档和使用说明。
- Bowtie2:用于将reads比对到参考基因组。它结合了快速的seed-and-extend算法和最大可信权值路径算法,适用于短序列的比对。了解更多信息,请访问Bowtie2官方网站。
- 基因组装工具:
- SPAdes:用于从测序reads中进行基因组组装,包括单细胞测序数据。它结合了de Bruijn图算法和多种优化策略,适用于各种类型的测序数据。你可以在SPAdes GitHub上找到更多信息和使用说明。
- Velvet:基于de Bruijn图的基因组组装工具,适用于短序列测序数据。它通过构建k-mer图来重建基因组序列。有关详细信息,请访问Velvet官方网站。
- SOAPdenovo:一个用于基因组组装的快速和高效的工具。它基于de Bruijn图算法,适用于大规模基因组的组装。了解更多信息,请访问SOAPdenovo官方网站。
- 比对工具:
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变异检测: 使用比对或基因组装的结果,识别和分析样本中的基因组变异。这些变异可能包括单核苷酸多态性(SNPs)、插入/缺失(indels)、基因重排等。变异检测的方法和工具会根据研究目的而有所不同。
- GATK(Genome Analysis Toolkit):GATK是一个广泛使用的工具集,用于基因组数据的分析和变异检测。它提供了多种算法和工具,包括基因组重比对、SNP/Indel检测、变异过滤等。了解更多信息,请访问GATK官方网站。
- VarScan:VarScan是一种用于检测SNPs、Indels和结构变异的工具,特别适用于对比分析。它能够从比对数据中识别变异,并提供统计学过滤和注释。有关详细信息,请访问VarScan官方网站。
- FreeBayes:FreeBayes是一个开源的SNP和Indel检测工具,能够从测序数据中检测变异。它采用贝叶斯统计方法进行变异检测,并提供了高灵敏度和准确性。了解更多信息,请访问FreeBayes GitHub。
- MuTect:MuTect是一个专门用于检测肿瘤样本中的突变的工具。它可以分析肿瘤-正常对比数据,并鉴定出肿瘤样本中的突变。了解更多信息,请访问MuTect官方网站。
- Samtools:Samtools是一个用于处理比对数据(SAM/BAM格式)的工具集,同时也提供了一些变异检测功能。它可以进行SNP/Indel检测、过滤和注释等。有关详细信息,请访问Samtools官方网站。
- Platypus:Platypus是一个灵活的变异检测工具,可以从WGS数据中检测SNPs、Indels和结构变异。它具有高度可配置性,并且支持多样本分析。了解更多信息,请访问Platypus GitHub。
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注释和功能分析: 对检测到的变异进行注释,确定其可能的功能和影响。注释可以包括变异在基因区域的位置、氨基酸改变的影响、潜在的功能通路等。
- ANNOVAR:ANNOVAR是一个用于注释基因组变异的工具,可以根据各种数据库提供详细的注释信息。它支持多种变异类型的注释,包括SNP、Indel、结构变异等。了解更多信息,请访问ANNOVAR官方网站。
- Variant Effect Predictor (VEP):VEP是一个广泛使用的工具,用于注释和预测变异的功能影响。它能够提供详细的注释信息,包括变异的基因影响、功能改变、突变致病性预测等。了解更多信息,请访问VEP官方网站。
- SnpEff:SnpEff是一个用于注释和预测SNP和结构变异的功能影响的工具。它能够提供变异的注释、基因影响、功能改变以及通路分析等。有关详细信息,请访问SnpEff官方网站。
- dbNSFP:dbNSFP是一个基因组功能预测数据库,提供了大量的注释和预测信息。它包含了来自多个公共数据库的功能预测结果,并提供了丰富的注释信息,如SIFT、PolyPhen-2、GERP++等。有关详细信息,请访问dbNSFP官方网站。
- DAVID:DAVID(Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery)是一个功能注释和富集分析工具,可以帮助用户理解基因组变异的功能和相关的生物学过程。它整合了多个公共数据库,提供了注释、功能分析和通路分析等功能。了解更多信息,请访问DAVID官方网站。
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结果解读和报告: 根据分析的结果,对基因组测序数据进行解读,并形成报告。报告可能涵盖样本的遗传风险、潜在的致病变异、药物敏感性等信息。
https://www.flowhub.com.cn/repo/flowhub_team/WholeGenomeSequencingFlow
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Step2:如果您没有FlowHub平台账号,订阅不会成功,将会进入FLOWHUB平台登录界面,已经有账号的直接账号密码登录进入平台,无账号点击“sign up”根据指引完成注册。
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Step3:登录进入平台,再次进入FLOWHUB标准流程订阅界面,再次点击“subscribe”,进行订阅,点击“Sure”完成订阅。
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Step4:订阅完成后进入Community-Subscribe Manage界面,添加对应标准流程进平台项目中,根据指引,点击“Sure”创建新项目。
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Step10:
- 在OutPut folder指定任务的所有输出文件的根目录;
- 在Input Flie根据端点名称,选择输入文件;
- 在Output Flie对需要标记的输出文件进行重命名;
- 查看job内使用的tool,进行个性化参数调整,CPU/GPU调整,如执行标准化流程无需更改。
- Step11:设置完成,根据指引完成job提交,等待计算结果。详细教程可查看https://doc.flowhub.com.cn/en/。
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