YuLab JC | 空间转录组学描绘了肺腺癌进展中的分子特征和细胞可塑性

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YuLab JC | 空间转录组学描绘了肺腺癌进展中的分子特征和细胞可塑性 by YuLabSMU

背景

肺癌是当今世界癌症死亡的首要原因，其中，腺癌是肺癌中最常见的组织病理学类型。2011年，国际肺癌研究协会、美国胸科学会及欧洲呼吸学会共同发布了肺腺癌的国际多学科分类方法。该分类方法将肺腺癌的组织病理学类型分为浸润前病变、原位腺癌、微浸润性腺癌、浸润性腺癌和浸润性腺癌变异型，2021年5月，第5版《世界卫生组织胸部肿瘤分类》将原分类中的浸润性腺癌重新命名为浸润性非黏液性腺癌，并提出浸润性非黏液性腺癌应根据组织学特征主要类型分为：贴壁样（lepidic, Lep）, 乳头样（papillary, P）, 腺泡样（acinar, A）， 微乳头（micropapillary, MP）and 实体样（solid, S）五类。多项研究显示出不同病理亚型的浸润性非黏液性腺癌在生物学特性、临床治疗及预后等方面均有所差异，例如MP和S亚型具有高度侵袭性，但其他亚型（Lep）表现出惰性生长。这些组织学亚型通常共存于同一肿瘤块中,呈现高度的空间异质性。本研究结合空间转录组学和多重荧光免疫组化技术，首次阐明了不同组织学亚型的分子特征和细胞可塑性。    

结果1：空间转录组学揭示 LUAD 的肿瘤内异质性

研究使用 10× Visium 平台对5名接受根治性切除术的肺腺癌患者样本进行空间中转录组测序。图1a是本研究的样本处理流程图，接着病理学家将样本注释为不同的组织学亚型，通过共享最近邻（SNN）模块化优化确定ST点转录特征的聚类，然后使用统一流形逼近和投影（UMAP）进行降维。以P5患者为例，病理学家注释为3部分：MP, 低分化腺泡（PA）和S（图1b），聚类为10簇（图1d, e）。    

图1：ST 显示的 LUAD 组织学亚型 

为了注释细胞，作者使用正常人肺的综合单细胞数据集作为参考，通过锚定分析来估计每个点内的细胞类型组成和细胞混合物的比例，可以发现巨噬细胞是最丰富的细胞类型，占所有细胞的13.39%(图2a)。接着对不同组织学亚型细胞组成的进一步相似性分析表明，主要细胞类型具有高度相似性（图2b），观察到不同组织学亚型中细胞比例的显着变化。PA亚型中棒状细胞的比例最高，而普通毛细血管细胞是正常肺组织中最丰富的细胞（图2c）。值得注意的是，S和MP亚型中巨噬细胞在所有细胞类型中所占比例最大，平均分别为13.21%和15.71%（图2d）。    

图2：跨组织学亚型的细胞组成的鉴定和表征    

为了探索巨噬细胞在 TME 中跨组织学亚型的功能，作者整合了两个公共scRNA-seq数据集，使用多模态交叉分析（MIA）算法（Nat Biotechnol. 2020;38(3):333-342.）评估巨噬细胞的表型差异。阐述了不同组织学亚型的巨噬细胞表型异质性，例如瘤相关巨噬细胞（TAMs）在S亚型中富集。在PA、MP和S亚型中，与血管生成相关的巨噬细胞数量明显较多。相比之下，吞噬作用相关的巨噬细胞在PA和S亚型中减少。此外，肺泡驻留巨噬细胞更倾向于驻留在正常组织中（图2e）。

结果2：亚型进展过程中缺氧

为了探索形成组织学亚型内在差异的分子机制，我们利用 SCENIC算法（Nat Methods. 2017;14(11):1083-1086.）进行了调控网络推断，并确定了由转录因子（TF）及其下游靶标组成的调控子。肿瘤增殖调控因子HMGB339 和线粒体复合体亚基UQCRB分别在样本ST_P1和ST_P7中富集（图3a）。既往研究发现缺氧诱导因子1α（HIF1A）影响肿瘤的发生、侵袭和转移，与 PA 和 MP 亚型相比，S 亚型的HIF1A调节子活性明显更高（图3b）。在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）队列中，从lep到高级别亚型，HIF1A调节子的活性都在增加。S亚型和MP亚型之间没有观察到明显差异，这可能是由于TCGA队列的组织学注释是基于主要亚型，TCGA队列中的每个样本只注释了一种组织学亚型（图3b）。此外，高 HIF1A 调节子活性与较差的总生存率相关（图3c）。为了进一步估计不同组织学亚型的不同缺氧水平（以P5患者举例），我们将缺氧标志物基因（HIF1A和CA9）应用于空间spot（图3d）。免疫组化染色证实了肿瘤中 CA9 表达的增加（图3e）。将缺氧特征评分应用于空间spot,S 亚型的缺氧特征得分更高（图3f），这结果与 TCGA 队列一致（图3g）。    

图3：亚型进展的转录调控网络

结果3：细胞信号传导的渐进变化    

  为了研究亚型进展所依赖的调控网络和生物学过程的信号通路，作者对MSigDB库中的约1800个基因组进行了富集分析，其中包括标志性基因组和经典通路。结果发现了亚型特异性通路（图4a）。例如，MYC调控通路、上皮-间质转化、PI3K/AKT/mTOR信号转导、P53通路和缺氧是S亚型的主要生物学过程（图4b）。此外，糖酵解和葡萄糖生成通路在PA亚型中富集，E2F 靶向基因在MA和PA亚型中富集，表面活性物质代谢在lep亚型中富集（图4b）。

然后，作者利用Jaccard相似性评估了亚型相关的信号通路之间的内在关系。构建了一个互作网络（图4c）。根据生物功能，这些通路具有内在的相互作用，并被分类为几类，如免疫、细胞周期、致癌、代谢、细胞外基质（ECM）组织等。    

图4：组织学亚型之间细胞信号传导的特征         

 

结果4：不同组织学亚型去分化状态的异质性

  由于去分化过程与肿瘤进展有关，为了深入了解亚型特异性动态去分化变化，作者使用 Monocle2和 CytoTRACE进行去分化分析，并可视化发育轨迹（图5a）以P1患者举例，P1样本包括三种组织学亚型：MP、PA和正常（N）组织（图5b）。正如预期，N区表现出更高分化的状态，而在PA亚型中观察到分化程度较低的状态，与组织学注释一致（图5b）。MP亚型表现出亚型内分化状态异质性（图5b）和混合空间簇（图5c）。表现为在 MP特异性簇中，簇 9（图5c）位于 PA 边界，表明亚型进展中存在潜在的过渡形态。对于MP亚型，在其他样本中观察到跨越整个分化状态的类似分化异质性（图5d）。    

  接下来，作者通过 Pearson 相关性鉴定了与 PA（分化程度较低）与 MP（分化程度较高）亚型中的去分化过程相关的基因（图5e）。鉴定了一批去分化标记基因，如TMSB4X和PLAT，在PA亚型中高度富集，而MGP和CLU则偏向于分化良好的亚型（图5f）。同时，如GO分析所示，它们在发育和分化途径显着富集（图5g）。

  微乳头簇特异性标记物是TMSB10，先前的研究也证明TMSB10是肿瘤进展和转移的关键调节因子。以P6举例，将TMSB10表达应用在空间上，可以看到这些微乳头簇中TMSB10的高表达（图5i），并且在TCGA中TMSB10的高表达与总体生存率显着降低相关。    

图5：不同组织学亚型的去分化状态的异质性

结果5：亚型特异性免疫景观

为了说明跨LUAD亚型的TME的免疫特征，作者用热图展示了各种免疫细胞中表达的免疫抑制基因和共信号分子的空间分布（图6a），高级别(PA, MP和S)亚型表现出免疫抑制表型，特别是S亚型。TNFRSF14（Tregs 标志物）和XBP1在MP亚型中显著表达，而在S100A9（MDSC 标记物）中观察到相反的趋势(图6b)。M2样巨噬细胞(CD68+, CD163+, MRC1/CD206+)，被称为抗炎和促肿瘤生成巨噬细胞，在各种组织学亚型中大量存在(图6a, c)。MP簇中CD68表达的增加在TCGA队列中得到验证(图6d, e)    

为了描述细胞-细胞间通讯网络的特征，作者使用CellPhoneDB推断配体受体相互作用（MIF-TNFRSF14是显着富集的配体-受体对）（图6f），巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）先前被报道为调节先天免疫的细胞因子，在各种癌症中过度表达并参与M2样巨噬细胞极化。    

图6：组织学亚型的免疫特征

结果6：mIHC 跨组织学亚型巨噬细胞的空间分布

最后作者通过多重免疫组化mIHC验证上述分析结果，使用另一个包含 92 个肿瘤和 88 个邻近正常组织的队列来进行 mIHC，mIHC 测定包括位于细胞膜、细胞质或细胞核中的几种巨噬细胞标记物（图7a）：    

l肿瘤细胞的细胞角蛋白标记物:Pan-CK；

l巨噬细胞标记物:CD68；

lM1 样巨噬细胞标记物:IRF8；

lM2 样巨噬细胞:CD163 和 CD206；

作者发现CD68+IRF8+与CD68+CD206+和CD68+CD163–CD206+TAM显着共定位（图7b），反映了体内巨噬细胞极化的动态过程。肿瘤细胞密度从正常区域到实体亚型显着增加, CD68+CD163+巨噬细胞亚群也有类似的趋势（图7c）。在几个样本的血管区域观察到 CD68+CD206+巨噬细胞的富集（图7d）。

图7：巨噬细胞亚群的景观    

总结：

  首次使用空间转录组解析不同肺腺癌病理亚型的分子特征，研究了空间细胞组成、细胞信号异质性、去分化状态和免疫景观，特别是巨噬细胞从惰性到侵袭性组织学亚型的空间异质性。不过未能使用配对的肿瘤样本进行单细胞测序，而是使用正常人单细胞测序数据注释空转细胞是一个遗憾。    

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