Flexible preprocessing, alignment, QC, and quantification workflow for 10x Genomics data (Chromium, Visium, & STRS)
The goal of this project is to build a workflow for assessing different alignment parameterizations, and digging into artifacts that arise from modifying 10x's chemistries. Contributions are welcome! See the companion workflow for Curio's SlideSeq (Seeker) here.
cutadaptv4.1fastqcv0.11.8STARv2.7.10b # Important!kallistov1.0.7bustoolsv0.1.0.dev2umi-toolsv1.1.2qualimapv2.2.avsearchv2.17.0BLAST
| sampleID | fastq_R1 | fastq_R2 | chemistry | STAR_rRNA_ref | STAR_ref | genes_gtf | kb_idx | kb_t2g |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| sample1 | /path/to/sample1_L001_R1.fastq.gz /path/to/sample1_L002_R1.fastq.gz | /path/to/sample1_L001_R2.fastq.gz /path/to/sample1_L002_R2.fastq.gz | Visium | /path/to/STAR_reference_rRNA | /path/to/STAR_reference | /path/to/annotations.gtf | /path/to/kallisto/transcriptome.idx | /path/to/kallisto/transcripts_to_genes.txt |
| sample2 | /path/to/sample2_L001_R1.fastq.gz /path/to/sample2_L002_R1.fastq.gz | /path/to/sample2_L001_R2.fastq.gz /path/to/sample2_L002_R2.fastq.gz | STRS | /path/to/STAR_reference_rRNA | /path/to/STAR_reference | /path/to/annotations.gtf | /path/to/kallisto/transcriptome.idx | /path/to/kallisto/transcripts_to_genes.txt |
Ribosomal RNA (rRNA) molecules can make alignment/quantification very difficult because of the number of genomic copies of these genes. We added a first-pass-alignment just to rRNA sequences to enable stratified parameterization for these sequences, but maintain the ability to count and analyze them.
Check out scripts/GRCm39_GENCODEM31_STAR_rRNA.sh for an example script showing how to generate a rRNA-only STAR reference using GENCODE annotations.
This is a typical STAR reference that you would use for any other alignment job. Here is an example code snippet:
FASTA_GENOME="/path/to/GENCODE_M31/GRCm39.genome.fa"
GENES_DIR="/path/to//GENCODE_M31/gencode.vM31.annotation.gtf"
OUTDIR="/workdir/dwm269/genomes/mm39_all/STAR_GRCm39_GENCODEM31"
mkdir -p ${OUTDIR}
cd ${OUTDIR}
STAR \
--runThreadN 16 \
--runMode genomeGenerate \
--genomeDir ${OUTDIR} \
--genomeFastaFiles ${FASTA_DIR} \
--sjdbGTFfile ${GENES_DIR} \
--sjdbGTFfeatureExon exon
You can find the reference files on GENCODE's website
{SAMPLE_ID}/
├── log.cutadapt.json
├── postTrim_fastqc_R2
│ ├── {SAMPLE_ID}_R2_final_fastqc.html
│ └── {SAMPLE_ID}_R2_final_fastqc.zip
├── preTrim_fastqc_R1
│ ├── {SAMPLE_ID}_R1_fastqc.html
│ └── {SAMPLE_ID}_R1_fastqc.zip
├── preTrim_fastqc_R2
│ ├── {SAMPLE_ID}_R2_fastqc.html
│ └── {SAMPLE_ID}_R2_fastqc.zip
├── qualimap
│ ├── css
│ │ ├── agogo.css
│ │ ├── ajax-loader.gif
│ │ ├── basic.css
│ │ ├── bgfooter.png
│ │ ├── bgtop.png
│ │ ├── comment-bright.png
│ │ ├── comment-close.png
│ │ ├── comment.png
│ │ ├── doctools.js
│ │ ├── down.png
│ │ ├── down-pressed.png
│ │ ├── file.png
│ │ ├── jquery.js
│ │ ├── minus.png
│ │ ├── plus.png
│ │ ├── pygments.css
│ │ ├── qualimap_logo_small.png
│ │ ├── report.css
│ │ ├── searchtools.js
│ │ ├── underscore.js
│ │ ├── up.png
│ │ ├── up-pressed.png
│ │ └── websupport.js
│ ├── images_qualimapReport
│ │ ├── Coverage Profile Along Genes (High).png
│ │ ├── Coverage Profile Along Genes (Low).png
│ │ ├── Coverage Profile Along Genes (Total).png
│ │ ├── Junction Analysis.png
│ │ ├── Reads Genomic Origin.png
│ │ └── Transcript coverage histogram.png
│ ├── qualimapReport.html
│ ├── raw_data_qualimapReport
│ │ ├── coverage_profile_along_genes_(high).txt
│ │ ├── coverage_profile_along_genes_(low).txt
│ │ └── coverage_profile_along_genes_(total).txt
│ └── rnaseq_qc_results.txt
├── rRNA_filtered_fastqc
│ ├── {SAMPLE_ID}_R1_final_filtered_fastqc.html
│ ├── {SAMPLE_ID}_R1_final_filtered_fastqc.zip
│ ├── {SAMPLE_ID}_R2_final_filtered_fastqc.html
│ └── {SAMPLE_ID}_R2_final_filtered_fastqc.zip
├── STARsolo
│ ├── Aligned.sortedByCoord.out.bam
│ ├── Aligned.sortedByCoord.out.bam.bai
│ ├── Log.final.out
│ ├── Log.out
│ ├── Log.progress.out
│ ├── SJ.out.tab
│ ├── Solo.out
│ │ ├── Barcodes.stats
│ │ ├── Gene
│ │ │ ├── Features.stats
│ │ │ ├── filtered
│ │ │ │ ├── barcodes.tsv
│ │ │ │ ├── features.tsv
│ │ │ │ └── matrix.mtx
│ │ │ ├── raw
│ │ │ │ ├── barcodes.tsv
│ │ │ │ ├── features.tsv
│ │ │ │ ├── matrix.mtx
│ │ │ │ └── UniqueAndMult-EM.mtx
│ │ │ ├── Summary.csv
│ │ │ └── UMIperCellSorted.txt
│ │ ├── GeneFull
│ │ │ ├── Features.stats
│ │ │ ├── filtered
│ │ │ │ ├── barcodes.tsv
│ │ │ │ ├── features.tsv
│ │ │ │ └── matrix.mtx
│ │ │ ├── raw
│ │ │ │ ├── barcodes.tsv
│ │ │ │ ├── features.tsv
│ │ │ │ ├── matrix.mtx
│ │ │ │ └── UniqueAndMult-EM.mtx
│ │ │ ├── Summary.csv
│ │ │ └── UMIperCellSorted.txt
│ │ ├── SJ
│ │ │ ├── Features.stats
│ │ │ ├── raw
│ │ │ │ ├── barcodes.tsv
│ │ │ │ ├── features.tsv
│ │ │ │ └── matrix.mtx
│ │ │ └── Summary.csv
│ │ └── Velocyto
│ │ ├── Features.stats
│ │ ├── filtered
│ │ │ ├── ambiguous.mtx
│ │ │ ├── barcodes.tsv
│ │ │ ├── features.tsv
│ │ │ ├── spliced.mtx
│ │ │ └── unspliced.mtx
│ │ ├── raw
│ │ │ ├── ambiguous.mtx
│ │ │ ├── barcodes.tsv
│ │ │ ├── features.tsv
│ │ │ ├── spliced.mtx
│ │ │ └── unspliced.mtx
│ │ └── Summary.csv
│ ├── Unmapped.out.mate1.fastq.gz
│ └── Unmapped.out.mate2.fastq.gz
├── STARsolo_rRNA
│ ├── Aligned.sortedByCoord.out.bam
│ ├── Aligned.sortedByCoord.out.bam.bai
│ ├── Log.final.out
│ ├── Log.out
│ ├── Log.progress.out
│ ├── SJ.out.tab
│ └── Solo.out
│ ├── Barcodes.stats
│ └── GeneFull
│ ├── Features.stats
│ ├── filtered
│ │ ├── barcodes.tsv
│ │ ├── features.tsv
│ │ └── matrix.mtx
│ ├── raw
│ │ ├── barcodes.tsv
│ │ ├── features.tsv
│ │ ├── matrix.mtx
│ │ └── UniqueAndMult-EM.mtx
│ ├── Summary.csv
│ └── UMIperCellSorted.txt
├── tmp
│ ├── {SAMPLE_ID}_R1_final_filtered.fq.gz
│ ├── {SAMPLE_ID}_R1_final.fq.gz
│ ├── {SAMPLE_ID}_R1.fq.gz
│ ├── {SAMPLE_ID}_R2_final_filtered.fq.gz
│ ├── {SAMPLE_ID}_R2_final.fq.gz
│ └── {SAMPLE_ID}_R2.fq.gz
└── Unmapped_fastqc
├── Unmapped.out.mate1_fastqc.html
├── Unmapped.out.mate1_fastqc.zip
├── Unmapped.out.mate2_fastqc.html
└── Unmapped.out.mate2_fastqc.zip