Fiji:stitching
El plugin de stitching puede leer los .zvi directamente, jalando de los metadatos las coordenadas de la adquisición. Eso significa que incluso podemos olvidar si adquirimos el mosaico como comb o como snake (wander), y de todas maneras queda bien!
Y listones.
El formato .zvi es propietario de Zeiss, pero en realidad es un tiff modificado con un poco de metadatos al principio. Afortunadamente, bioformats sabe leerlo y convertirlo a otros formatos más modernos y amigables.
Descargamos las "command line tools" de bioformats, y las descomprimimos a una nueva carpeta. Luego, esa carpeta la agregamos al PATH con un export. Por ejemplo, en mi compu de la casa:
export PATH=/datos/syphon/lconcha/software/bftools:${PATH}
El comando que queremos es bfconvert. Está padre, y nos ayuda a dividir la imagen como queramos. Yo la quiero frame por frame, pero en este caso se llama series. Por ejemplo, para convertir una imagen .zvi a muchos .png, uno para cada frame uso:
bfconvert -channel 0 69B-30-Foxp2-40x.zvi tostitch/ch_%s_chan1.png
El -channel 0 indica que solo quiero el primer canal (mi ejemplo es una imagen de dos canales; si hubiera querido el segundo canal hubiera indicado -channel 1).
La clave está en el %s en el output filename. Es un placeholder que cambiará en función de los archivos de salida. Al final, en la carpeta tostitch voy a tener muchos archivos .png diferenciados por su índice. Estúpidamente, bfconvert escribe números sin "padding", por lo que es necesario cambiarlos a tener una longitud similar para que alfabéticamente tengan sentido (que no vaya primero el 1 que el 10). Hay muchas maneras de hacerlo, pero haré uso de zeropad de fsl.
cd tostitch
for f in *chan1.png
do
s=`echo $f | awk -F_ '{print $2}'`
mv $f f_`zeropad $s 3`.png
done
ℹ️ El formato png seguramente no es la mejor opción para lidiar con estas imágenes, debería estar usando tiff, pero para las pruebas basta el png.
Vamos a Plugings, Stitching, Grid/Collection Stitching. Dependiendo si el mosaico se obtuvo con barrido meander o comb, seleccionamos grid snake by rows o grid row by row respectivamente.
Hay que decirle de qué tamaño es el mosaico (yo lo saqué por ensayo/error, pero pues hubiera sido mejor haberlo apuntado en una bitácora). Se le indica también dónde está la carpeta con los archivos y la nomenclatura de los mismos.
Las iii en los File names for tiles indican los índices de los archivos que cambiamos con el zeropad.
Le damos OK y unos diez segundos después tenemos el resultado:
Si nos equivocamos en lo de meander/comb o el número de cuadros, veremos algun resultado medio loco.
Hacer un script en Fiji que primero haga un subtract background cuadro por cuadro y luego haga el stitching.