Fiji:stitching]
El plugin de stitching puede leer los .zvi directamente, jalando de los metadatos las coordenadas de la adquisición. Eso significa que incluso podemos olvidar si adquirimos el mosaico como comb o como snake (wander), y de todas maneras queda bien!
Y listones.
El formato .zvi es propietario de Zeiss, pero en realidad es un tiff modificado con un poco de metadatos al principio. Afortunadamente, bioformats sabe leerlo y convertirlo a otros formatos más modernos y amigables.
Descargamos las "command line tools" de bioformats, y las descomprimimos a una nueva carpeta. Luego, esa carpeta la agregamos al PATH con un export. Por ejemplo, en mi compu de la casa:
export PATH=/datos/syphon/lconcha/software/bftools:${PATH}
El comando que queremos es bfconvert. Está padre, y nos ayuda a dividir la imagen como queramos. Yo la quiero frame por frame, pero en este caso se llama series. Por ejemplo, para convertir una imagen .zvi a muchos .png, uno para cada frame uso:
bfconvert -channel 0 69B-30-Foxp2-40x.zvi tostitch/ch_%s_chan1.png
El -channel 0 indica que solo quiero el primer canal (mi ejemplo es una imagen de dos canales; si hubiera querido el segundo canal hubiera indicado -channel 1).
La clave está en el %s en el output filename. Es un placeholder que cambiará en función de los archivos de salida. Al final, en la carpeta tostitch voy a tener muchos archivos .png diferenciados por su índice. Estúpidamente, bfconvert escribe números sin "padding", por lo que es necesario cambiarlos a tener una longitud similar para que alfabéticamente tengan sentido (que no vaya primero el 1 que el 10). Hay muchas maneras de hacerlo, pero haré uso de zeropad de fsl.
cd tostitch
for f in *chan1.png
do
s=`echo $f | awk -F_ '{print $2}'`
mv $f f_`zeropad $s 3`.png
done
ℹ️ El formato png seguramente no es la mejor opción para lidiar con estas imágenes, debería estar usando tiff, pero para las pruebas basta el png.
Vamos a Plugings, Stitching, Grid/Collection Stitching. Dependiendo si el mosaico se obtuvo con barrido meander o comb, seleccionamos grid snake by rows o grid row by row respectivamente.
Hay que decirle de qué tamaño es el mosaico (yo lo saqué por ensayo/error, pero pues hubiera sido mejor haberlo apuntado en una bitácora). Se le indica también dónde está la carpeta con los archivos y la nomenclatura de los mismos.
Las iii en los File names for tiles indican los índices de los archivos que cambiamos con el zeropad.
Le damos OK y unos diez segundos después tenemos el resultado:
Si nos equivocamos en lo de meander/comb o el número de cuadros, veremos algun resultado medio loco.
Hacer un script en Fiji que primero haga un subtract background cuadro por cuadro y luego haga el stitching.